PKC信号通路在树突状细胞介导糖尿病动脉粥样硬化炎症反应中作用及机制探讨

【摘要】随着我国国民膳食结构的改变以及人口老龄化的提前到来,糖尿病在社会疾病谱中所占的比例正在逐年增长。研究发现,糖尿病患者患冠心病的风险是非糖尿病患者的2-6倍,血糖异常不仅是影响冠状动脉病变的独立危险因素,还是影响冠状动脉介入术后心功能恢复的重要影响因素。糖尿病作为冠心病的等危证,其所引发的冠状动脉粥样硬化表现出一些特征性病变,如多支血管病变,病变部位斑块呈现弥漫性,病变以小血管为主、狭窄程度较重等特点,充分说明了在糖尿病患者中,动脉粥样硬化的发生发展过程有其独特的机制,这也是国际上的一个研究热点。本研究发现STZ诱导的糖尿病ApoE-/-小鼠建模8周后,其主动脉根部粥样硬化的严重程度加重,且斑块不稳定性增加,表现为胶原减少,而巨噬细胞、树突状细胞含量增加；另一方面,我们也发现糖尿病ApoE-/-小鼠其外周血炎症因子如TNFα和IFNγ表达增加,主动脉ICAM和VCAM表达升高,呈现慢性低度炎症表现,这与既往报道是一致的；此外,我们还发现作为体内最强的专职抗原递呈细胞——DCs不仅在斑块局部含量增加,而且脾脏DCs表达CD83等成熟表型增强,抗原递呈能力增加。以上说明DCs所介导的免疫炎症反应可能参与了糖尿病动脉粥样硬化的病理生理过程。为了进一步说明DCs在糖尿病动脉粥样硬化内环境中的成熟机制,我们在体外用GM-CSF和IL4诱导小鼠骨髓细胞分化为DCs,利用oxLDL+AGEs模拟糖尿病动脉粥样硬化的高糖高脂内环境进行刺激(对照组单纯应用oxLDL模拟ApoE-/-小鼠的高脂内环境),干预48h后发现AGEs能够在oxLDL的基础上进一步诱导DCs免疫成熟,表现为成熟标志CD83和共刺激分子CD86显著升高；同时,TNFα、IFNγ以及白介素和趋化因子等致炎性细胞因子的表达也升高；最终促进了T淋巴细胞的增殖反应。此外,在我们既往的研究中,发现AGEs能够诱导DCs高表达RAGE,在本研究中,我们发现AGEs不仅能够在oxLDL基础上诱导DCs高表达RAGE,还能诱导PKCα/β1/β2磷酸化并转膜,进而激活TLR4信号通路,促进NF-κB转核,诱导炎症因子转录。在上述发现的基础上,我们首先利用RAGE中和抗体和TLR4抑制剂处理oxLDL+AGEs刺激的DCs,发现经过RAGE中和抗体或TLR4抑制剂处理后,PKCβ1的磷酸化被抑制,DCs的免疫成熟也被抑制。为了进一步说明PKC信号通路在DCs免疫成熟中的作用,我们分别应用了PKCα印制剂、PKCβ1抑制剂、PKCβ2抑制剂以及PKC激动剂PMA,结果发现PMA能够促进DCs的免疫成熟,而这种作用能被PKCβ1抑制剂下调,但是PKCα抑制剂和PKCβ2抑制剂没有类似的效应。同时,我们也发现应用PKCβ1抑制剂后RAGE和TLR4的表达没有显著的变化,而TLR4的下游信号分子IRAK的磷酸化却受到显著抑制,提不PKCβ的磷酸化与TLR4下游信号IRAK相关。最后,我们分别应用RAGE中和抗体、TLR4抑制剂和PKC[1抑制剂进行干预,发现NF-κB、IKB的磷酸化都呈现了显著的下调,进一步说明了oxLDL+AGEs能够通过RAGE-TLR4-pPKCβ1信号通路促进DCs的免疫成熟。但RAGE、TLR4、pPKCβ1这三者之间在膜上是处于怎样的关系呢?我们利用TLR4抗体免疫共沉淀RAGE和phospho-PKCβ1,结果发现TLR4受体与RAGE、phospho-PKCβ1之间是通过某种固定关系结合在一起；而经过AGEs在oxLDL的基础上进一步干预后,phospho-PKCβ1.RAGE的结合量也显著增高；反过来,我们应用phospho-PKCβ1免疫共沉淀RAGE,证明了phospho-PKCβ1与RAGE在膜上也处于结合状态。以上结果证明了我们假设的RAGE-TLR4-pPKCβ1在膜上处于三位一体、存在受体间相互作用的模型理论是成立的。最后,我们在糖尿病ApoE-/-小鼠模型中应用PKCβ抑制剂LY333531,发现LY333531能够显著下调糖尿病ApoE-/-小鼠外周血中TNFa和IFNγ的表达,抑制脾脏DCs的免疫成熟,延缓和逆转主动脉根部粥样硬化的进展。综合以上研究成果,我们认为PKCβ1信号通路激活在DCs介导的糖尿病慢性低度炎症中起着重要作用；AGEs能够通过与RAGE受体的结合,激活TLR4信号通路,在招募IRAK的同时伴随着PKCβ1的磷酸化和转膜,转膜后的phospho-PKCβ1磷酸化IRAK,诱导NF-κB的磷酸化和转核,最后促进了DCs的免疫成熟；PKCβ抑制剂能够显著下调糖尿病慢性低度炎症反应,可能对糖尿病动脉粥样硬化具有一定的临床指导意义,为进一步的药物临床试验奠定了基础。第一部分糖尿病ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化加重伴随着慢性低度炎症和树突状细胞的激活目的：探讨合并糖尿病的ApoE-/-小鼠是否存在免疫炎症反应增强、动脉粥样硬化加重等现象。方法：16只8周龄ApoE-/-小鼠随机分成对照组和糖尿病组,糖尿病组利用STZ诱导成模,分别观察8周,测量血糖、血脂和体重。利用主动脉根部冰冻切片油红染色测定斑块体积,Masson染色测定斑块内胶原含量,CD68、CD11c免疫荧光染色明确斑块内巨噬细胞和DCs的含量；其次,利用ELISA检测外周血TNFα、IFNγ的浓度,qPCR测定主动脉ICAM、VCAM表达；最后,利用CD11c磁珠分选脾脏DCs,流式细胞术检测CD83、CD86,qPCR检测致炎性细胞因子和趋化因子的表达。结果：糖尿病ApoE-/-小鼠血糖显著升高伴随着体重下降,而血脂谱没有明显改变。糖尿病ApoE-/-小鼠主动脉根部粥样硬化斑块体积较对照组显著增加,且斑块内胶原含量下降,巨噬细胞和DCs含量增加；外周血TNFα和IFNγ浓度显著升高,主动脉ICAM、VCAM表达上调；脾脏DCs表达CD83、CD86显著升高,IL12b、IL4、IL6等致炎性细胞因子和CCL4、CCR7、CXCR4等趋化因子表达也显著上调。结论：糖尿病能够诱导DCs介导的慢性低度炎症反应,并与动脉粥样硬化斑块的体积和稳定性密切相关。第二部分AGEs在oxLDL的基础上进一步诱导树突状细胞免疫成熟并激活经典型PKC信号通路目的：研究AGEs能否在oxLDL的基础上进一步诱导DCs免疫成熟,并探讨其可能的机制。方法：利用GM-CSF和IL4诱导C57小鼠骨髓细胞分化成DCs后分别予以oxLDL和oxLDL+AGEs干预48h。流式细胞术检测CD83、CD86等表面标志的表达,qPCR测定细胞因子和趋化因子的转录,ELISA检测细胞培养上清液中TNFaα和IFNγ的表达,westernblot检测NF-κB和IKB的磷酸化程度,并利用同种异体T淋巴细胞增殖反应进行验证。在此基础上,利用westernblot检测经典型PKC的磷酸化程度以及RAGE和TLR4信号通路的表达。结果：AGEs能在oxLDL的基础上进一步诱导DCs表达成熟标记CD83和共刺激分子CD86,ELISA和qPCR提示致炎性细胞因子和趋化因子的表达显著上调,NF-κB和IKB的磷酸化程度上升。AGEs能在oxLDL的基础上进一步诱导DCs上调RAGE的表达和PKCα/β1/β2的磷酸化,并激活了TLR4信号通路。结论：AGEs能够在oxLDL的基础上进一步诱导DCs的免疫成熟,其机制可能涉及到RAGE-TLR4-PKC信号通路。第三部分RAGE-TLR4-pPKCβ1信号通路影响AGEs在oxLDL基础上诱导树突状细胞免疫成熟目的：研究AGEs在oxLDL基础上诱导DCs免疫成熟的可能分子机制。方法：利用GM-CSF和IL4诱导C57小鼠骨髓细胞分化成DCs后,隔天换液,并在第六天加oxLDL+AGEs干预时分别利用RAGE中和抗体、TLR4抑制剂、PKCα抑制剂、PKCβ1抑制剂、PKCβ2抑制剂以及PMA进行信号分子干预。流式细胞术检测CD83、CD86等表面标志的表达,ELISA检测细胞培养上清液中TNFα和IFNγ的表达,westernblot检测TLR4-NF-κB信号通路的激活程度。在此基础上,利用TLR4抗体免疫共沉淀phospho-PKCβ1和RAGE,以及利用phospho-PKCβ1抗体免疫共沉淀RAGE。结果：RAGE中和抗体、TLR4抑制剂以及PKCβ1抑制剂能够显著抑制AGEs在oxLDL基础上所诱导的DCs免疫成熟,而PKCα抑制剂、PKCβ2抑制剂没有这种效应；PKC激动剂PMA能够促进DCs免疫成熟,这种效应能被PKC(31抑制剂所抑制。IP证明RAGE-TLR4-pPKCβ1三者在细胞膜上处于结合状态,存在受体间相互作用；结论：RAGE-TLR4-pPKCβ1信号通路可能是AGEs在oxLDL基础上进一步诱导DCs免疫成熟的分子机制。第四部分LY333531抑制糖尿病ApoE-/-小鼠树突状细胞免疫成熟并逆转主动脉粥样硬化的进展目的：验证PKCβ抑制剂LY333531能否逆转糖尿病动脉粥样硬化进展。方法：16只8周龄ApoE-/-小鼠经STZ诱导糖尿病后随机分成对照组和LY333531给药组(3mg.kg-1.d-1),干预8周后测定血糖、血脂和体重。CD11c磁珠分选脾脏DCs,流式细胞术检测CD83、CD86,qPCR检测致炎性细胞因子和趋化因子的表达。其次,利用ELISA检测外周血TNFα、IFNγ的浓度,qPCR检测主动脉ICAM、VCAM表达；最后,主动脉根部冰冻切片油红染色测定斑块体积,Masson染色测定斑块内胶原含量,CD86、CD11c免疫荧光染色明确斑块内巨噬细胞和DCs的含量。结果：LY333531给药组ApoE-/-小鼠血糖和血脂较对照组无显著性差异,而体重显著增加。脾脏DCs表达CD83、CD86被显著抑制,致炎性细胞因子和趋化因子的分泌也显著下调；外周血TNFα和IFNγ浓度显著下降,主动脉ICAM、VCAM表达减少；主动脉根部粥样硬化斑块体积较对照组显著减轻,且斑块内胶原含量升高,巨噬细胞和DCs含量下降。结论：LY333531能够独立于血糖和血脂因素抑制糖尿病动脉粥样硬化内环境所诱导的DCs免疫成熟,进而降低糖尿病全身慢性低度炎症反应,并逆转和稳定动脉粥样硬化斑块。结论1.糖尿病能够诱导DCs介导的慢性低度炎症反应,并与动脉粥样硬化斑块的体积和稳定性密切相关。2.AGEs能在oxLDL的基础上进一步诱导DCs的免疫成熟,其可能机制是通过RAGE-TLR4-pPKCβ1信号通路。3.LY333531能够抑制糖尿病动脉粥样硬化内环境所诱导的DCs免疫成熟,进而降低糖尿病全身慢性低度炎症反应,并逆转和稳定动脉粥样硬化斑块。创新点和研究意义1.本课题首次在体外阐明了糖尿病动脉粥样硬化环境中DCs免疫成熟的具体机制,并提出了PKCβ1亚型作为靶点干预DCs免疫成熟在糖尿病性动脉粥样硬化发生发展中的潜在作用,从而为临床防治糖尿病性动脉粥样硬化提供了一个新思路。2.首次评估了PKCβ特异性抑制剂在预防和逆转糖尿病性动脉粥样硬化斑块形成中的作用,为进一步开展临床试验奠定了理论基础。
【作者】张文斌；
【导师】葛均波；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】DCs；糖尿病；动脉粥样硬化；炎症；AGEs；RAGE；PKC；TLR4；PKCβ1；LY333531；粥样硬化；树突状细胞；PKCβ；

【参考文献】
[1]赖后翔.高频开关电源DC-DC模块的研究[D].湖南大学,控制工程,2003,硕士.
[2]林伟盛.人促更新与人工造林初期土壤呼吸差异及机制[D].福建师范大学,生态学,2013,硕士.
[3]顾赛喜.基于新型石墨烯纳米复合材料的电极设计及应用[D].扬州大学,2013.
[4]朱继洲,徐茂义,杨基民.对试行浮动学制的一些认识[J].高等工程教育研究.1988(04)
[5]陆佳丽,薛明,许可颖,王雪.助力创业园,梦想正起飞——杭州市大学生创业及创业园现状浅析[J].现代物业(中旬刊),2014,12:30-32.
[6]汪冉冉.过量表达GCHI和ADCS基因对提高植物叶酸含量的研究[D].兰州大学,细胞生物学,2013,硕士.
[7]黄晓琳.霉菌毒素在肉鸡体内残留及其控制研究[D].浙江工商大学,食品科学与工程,2012,硕士.
[8]彭峰.成品油销售企业竞争力研究[D].西安理工大学,企业管理,2004,硕士.
[9]张永林,易启伟,王旺平,周立汉.立式精碾米机机组的设计[J].农业机械学报.2006(10)
[10]宋虎.汉代奏谳制度研究[D].苏州大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[11]汪毅.面向零售业客户关系管理的数据挖掘模型研究[D].湖南大学,2003.
[12]肖飒.中国基金会监督制度研究[D].扬州大学,民商法学,2012,硕士.
[13]赵硕.子宫颈鳞癌中NF-κB与VEGF的表达及其意义[D].辽宁医学院,病理学与病理生理学,2012,硕士.
[14]刘礼科.长沙市地质家园二期深基坑工程监测及变形预测[D].吉林大学,道路与铁道工程,2014,硕士.
[15]钟斐.地铁公共艺术的导向作用研究[D].厦门大学,设计艺术学,2014,硕士.
[16]吴蒙.基于SD与CLUE-S模型的快速城市化区域生态服务价值时空保护研究[D].华东师范大学,环境科学,2013,硕士.
[17]张剑宇.用于SPR传感的塞曼稳频激光器研究[D].哈尔滨工业大学,物理电子学,2013,硕士.
[18]何玲.我国有限合伙制私募股权基金法律问题研究[D].贵州民族大学,经济法学,2014,硕士.
[19]赵信刚.基于芳香体系的非线性光学材料设计及理论研究[D].吉林大学,物理化学,2014,硕士.
[20]叶祥熙.凝结势模型的建立与应用[D].复旦大学,原子与分子物理,2012,博士.
[21]梁婉玲.基于文化视角的家族企业治理模式探析[D].云南大学,工商管理,2012,硕士.
[22]唐文帮.水稻两用核不育系8015S的选育及应用研究[D].湖南农业大学,种植,2003,硕士.
[23]熊伟.小班幼儿语言能力培养的个案研究[D].华中师范大学,学前教育,2013,硕士.
[24]宋琪.地铁、地面交通振动荷载作用下北京正阳门古建筑的动力响应[D].北京交通大学,防灾减灾工程及防护工程,2014,博士.
[25]韩旻轩.大鼠正畸牙齿移动过程中张力侧牙周组织RUNX2、OSX、OPN的表达[D].南京医科大学,口腔临床医学,2013,硕士.
[26]杨建华.大豆皮替代麸皮饲喂生长肥育猪效果研究[D].湖南农业大学,农业推广,2003,硕士.
[27]李效锐.蒙古族装饰图案的审美特征及文化内涵研究[D].中国矿业大学,设计艺术学,2014,硕士.
[28]孙寅玮.ROCK对PDGF诱导大鼠血管平滑肌细胞MMP-2、MMP-9及MEF2A表达的初探[D].大连医科大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[29]陈焕.当代印度社会妇女安全问题研究[D].华中师范大学,世界史,2014,硕士.
[30]吴宗文.内江“三高”水产业的新思路[J].中国渔业经济.1994(02)
[31]李永虎.马尔库塞的乌托邦思想研究[D].复旦大学,马克思主义哲学,2013,博士.
[32]邓鸿敖.细胞外热休克蛋白70在严重烧伤大鼠肠粘膜的表达变化及其对肠道T细胞免疫功能的影响[D].南昌大学,外科学,2014,硕士.
[33]刘佳佳.阿音对蒙古族游牧文化纪实摄影人文关怀的研究[D].内蒙古农业大学,设计艺术学,2013,硕士.
[34]汲传波,刘芳芳.留学生汉语书面语中的口语化倾向研究[J].语言教学与研究,2015,01:31-37.
[35]肖文婷.结构化P2P网络负载均衡策略的研究[D].重庆大学,计算机系统结构,2014,硕士.
[36]韩珂,李耀通.机器人在任务空间的变结构跟踪控制[J].自动化学报,1992,03:297-305.
[37]周锦强.含苯胺四聚体的嵌段共聚物合成及对碳纳米管的修饰[D].华中科技大学,高分子化学与物理,2013,硕士.
[38]罗强.Toll样受体启动的信号通路在双歧杆菌脂磷壁酸诱导HCT-116细胞凋亡中作用[D].重庆医科大学,临床检验诊断学,2004,硕士.
[39]朱甜.从受容理论看文学翻译中译者的主体性[D].厦门大学,日语语言文学,2014,硕士.
[40]罗云波.计算机操作系统安全事件关联分析研究[D].四川大学,2004.
[41]冯远.内贾德执政以来伊朗强硬外交政策评析[D].新疆大学,国际政治,2013,硕士.
[42]谭崇梅.复杂产品系统合作创新激励约束模型研究[D].大连理工大学,项目管理,2013,硕士.
[43]顾幸方.基于随机森林的视觉跟踪算法研究及应用[D].南京理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[44]沈贤.地铁报商业模式创新研究[D].上海外国语大学,企业管理,2012,硕士.
[45]顾诞英.基于继电反馈的时滞系统自整定控制方法研究[D].上海交通大学,2010.
[46]崔艳.菊花提取物抑制小鼠高脂性脂肪肝形成及其机制研究[D].苏州大学,药理学,2014,硕士.
[47]高敏.论林语堂版《浮生六记》中文化负载词的英译[D].武汉理工大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[48]赵宏霞,杨皎平,郭嗣琮.基于时序关联规则的客户需求预测方法研究[J].科技和产业,2004,11:22-26.
[49]张黎.近年来陕西主流文化电视纪录片研究[D].西北大学,戏剧与影视学,2014,硕士.
[50]李静.陈东原教育史研究之研究[D].西南大学,教育史,2014,硕士.